細(xì)胞是包括人類在內(nèi)的絕大部分生命體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。細(xì)胞會不斷地接受周圍環(huán)境的信號，并相應(yīng)地轉(zhuǎn)變細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、有機(jī)小分子、離子、DNA和RNA等的數(shù)量、分布和活性狀態(tài)等，從而改變自身形態(tài)和生物學(xué)功能等。該過程的異常與疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。因此，科學(xué)家們往往通過檢測上述關(guān)鍵分子的時空變化來闡明相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制。
在該研究中，研究人員選取細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使分子環(huán)磷酸腺苷作為研究目標(biāo)。環(huán)磷酸腺苷可傳遞細(xì)胞表面多種G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的信息，在學(xué)習(xí)與記憶、藥物成癮、運動控制、免疫、代謝等過程中發(fā)揮重要作用。
“活細(xì)胞和活體水平的環(huán)磷酸腺苷分子濃度變化的高時空分辨率熒光成像是解析環(huán)磷酸腺苷信號通路及其生物學(xué)功能的重要基礎(chǔ)。因此，開發(fā)高靈敏的環(huán)磷酸腺苷熒光探針成為研究復(fù)雜生物過程的關(guān)鍵。”儲軍表示。
與非基因編碼探針相比，基因編碼探針像正常蛋白質(zhì)一樣，可以定位到生物體特定細(xì)胞或特定細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)，具有低毒性、低背景、可遺傳等優(yōu)點，在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究中具有無可比擬的優(yōu)勢。然而，現(xiàn)有的50多個基因編碼的環(huán)磷酸腺苷熒光探針要么靈敏度低(熒光變化最大只有1.5倍)，要么熒光亮度較暗，很難監(jiān)測活體中微弱的內(nèi)源性環(huán)磷酸腺苷變化，極大地限制了人們對生理和病理狀態(tài)下環(huán)磷酸腺苷分子調(diào)控機(jī)理和功能的研究。
為了開發(fā)適用于活體檢測的高靈敏度探針，研究人員將環(huán)化重排綠色熒光蛋白(cpGFP)插入細(xì)菌MlotiK1通道蛋白的環(huán)磷酸腺苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域(mlCNBD)中。經(jīng)過插入位點篩選、連接肽優(yōu)化、熒光蛋白及感應(yīng)模塊優(yōu)化，研究人員得到了具有高亮度、高靈敏度、合適親和力和快響應(yīng)速度等特征的高性能基因編碼的環(huán)磷酸腺苷綠色熒光探針(G-Flamp1)。該探針在活細(xì)胞中的熒光變化可達(dá)12倍，是目前少數(shù)幾個熒光變化在10倍以上的熒光探針之一。
隨后，研究人員將該探針應(yīng)用在果蠅和小鼠等模式生物中，結(jié)合雙光子成像和光纖記錄等技術(shù)，該探針可高靈敏檢測到環(huán)磷酸腺苷信號的動態(tài)變化。
在未來研究中，研究團(tuán)隊將進(jìn)一步提高探針性能，開發(fā)適用于不同應(yīng)用場景的下一代高靈敏環(huán)磷酸腺苷探針，并利用其揭示活細(xì)胞和活體中環(huán)磷酸腺苷信號的規(guī)律、調(diào)控機(jī)制及生物學(xué)功能。
來源：科技日報
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2022-11-18
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